HPTLC: Případová studie - konopí seté

1. Úvod

Konopí seté (Cannabis sativa) je rostlina, která je již velmi dlouhou dobu používána ve velmi rozličných aplikacích - od výroby textilních vláken po zmírňování bolesti. Díky obsahu psychotropních látek je v současné době ve většině zemí její použití úplně zakázáno, nebo alespoň silně regulováno. V poslední době je trendem uvolňování regulace a umožnění použití cannabinoidních přípravků pro lékařské použití (roztroušená skleróza, rakovina, epilepsie, modulace bolesti, ...).

Efekty konopných produktů způsobuje celá řada látek z nichž nejdůležitější a nejstudovanější jsou cannabidiol (CBD), Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), a cannabinol (CBN).

Předmětem státní regulace použití konopných produktů je v první řadě limitace obsahu THC. V závislosti na tom kterém státu je tento limit nastaven v rozmezí 0,2 až 1 % obsahu.

Předmětem této studie je rozdělení, identifikace a kvatifikace obsahu jednotlivých složek konopných extraktů.

Popisované postupy splňují požadavky uvedené v Evropském a Českém lékopise v kapitolách 2.8.25 na analýzu léčivých přípravků rostlinného původu.

2. Volba analytické metody

V analýze konopných produktů se můžeme setkat s celou řadou vzorků pro analýzu, které se liší svojí komplexností a stupněm čistoty. K analýze může být předložena celá rostlina, její část, sušina, pomletý prášek, extrakt, nebo individuální izolovaná sloučenina.

Předmětem analýzy může být:

• určení identity vzorku (určení druhu rostliny, určení typu sloučeniny),
• limitní test, nebo rčení účinnosti,
• stanovení obsahu jednotlivých kanabinoidů.

Ideální je pro všechny typy vzorků a pro všechny typy analýz použít jednotnou (ideálně shodnou) metodu. Takovou metodou je právě HPTLC analýza.

3. Analýza: Určení obsahu THC ve vzorku

Příprava vzorku není pro potřeby HPTLC nijak složitá. V daném případě se provedla extrakce z dodaného prášku vhodným rozpouštědlem. Následně byla suzpenze stočena a byl odebrán supernatant, který je již vhodný pro aplikaci na HPTLC desku.

Aplikace byla provedena pomocí přístroje CAMAG ATS (Automatic TLC Sampler) na HPTLC desku rozměru 20x10 cm.

Na desku bylo naneseno celkem 15 vzorků:

• standard v triplikátu,
• 6 vzorků v duplikátech.

Následně byla deska vyvinuta pomocí ADC (Automatic development chamber) s kontrolou vlhkosti ve vhodné mobilní fázi.

Cílový analyt THC je v konopných produktech zastoupen v různých formách (v tomto případě je to vlastní THC a jeho karboxylovaný derivát THCA), které jsou na sebe převoditelné a to i biochemickou transformací. Je proto důležité stanovovat celkový obsah THC ve všech jeho formách. Jedenou z možností je provést nejprve dekarboxyalaci, druhou možností je stanovit obsah jednotlivých látek samostatně a do výsledného obsahu započítat jejich součet.

Pro přesnou kvantifikaci obsahu zájmových látek na desce je vhodné provést densitometrickou analýzu pomocí přístroje CAMAG Scanner. Pro volbu vhodné vlnové délky.

Z profilu UV absorbance THC a THCA je zřejmé, že kvatifikaci THC je vhodné provádět při 210 nm a kvantifikaci THCA při 285 nm. Při použití přístroje TLC Scanner lze toto vyhodnocení provést v jednom kroku (multi-wavelength scan).

Pomocí software visionCATS, který obsluhuje jednotlivé přístroje pro HPTLC je poměrně jednoduché prvést kvantitativní analýzu během max. 5 minut.

Výsledkem může být např. limitní test, kdy se určí zda daný vzorek obsahuje větší nebo menší množství cílové látky:

Případně přesná kvantifikace obsahu látky ve vzorku včetně přené kalibrace:

Stejnnou analytickou metodu můžeme použít např. i pro identifikaci původu analyzovaného vzorku. Postup je shodný s předchozím příkladem, pouze se přidá několik dalších kroků. Prvním z nich je derivatizace vhodným činidlem (v našem případě sůl Fast Blue) pomocí přístroje CAMAG Derivatizer. Následuje vyhodnocení HDR fotografie desky pomocí přístroje CAMAG Visualizer a software visionCATS. Toto vyhodnocení zahrnuje srovnání s knihovnou známých vzorků.

Pro přesnou identifikaci látky na HPTLC (nebo TLC) desce můžeme krom určení Rf, stanovení jejího UV profilu provést také její izolaci a analýzu např. pomocí MS. Tuto izolaci je vhodné provést pomocí přístroje CAMAG TLC-MS Interface. Izolace látky a změření MS spektra je otázka max. 1 minuty a nehrozí při ní kontaminace mezi jednotlivými látkami na desce.

Podrobné případové studie o analýze konopných produktů včetně optimalizovaných separačních podmínek naleznete v aplikačních studiích společnosti CAMAG:

1. A-108.1 - Identification and quantification of different cannabinoids in Cannabis sativa,
2. A-98.1 Confirming the presence of cannabinoids in Cannabis sativa by HPTLC-MS.

Další případové studie naleznete zdarma ke stažení na webu výrobce zařízení pro HPTLC švýcarské společnosti CAMAG.